Conservação in vitro

1. Conservação in vitro compreende a manutenção de amostras de germoplasma vegetal utilizando-se a técnica da cultura de tecidos in vitro, em condições controladas de temperatura, fotoperíodo e em meio de cultura que favoreça o crescimento lento dos propágulos. A manutenção de uma coleção in vitro é garantida pela adoção de um conjunto de medidas científicas, técnicas e operacioinais, a fim de evitar a deterioração das amostras por meio da transferência periódica dos propágulos vegetais para frascos contendo meio de cultura novo, em condições assépticas. A conservação in vitro é uma metodologia que permite a conservação a médio prazo de germoplasma vegetal.. Ver Conservação.
2. técnica que permite a conservação de germoplasma a curto, médio e longo prazos, aplicável a espécies de propagação vegetativa ou que produzem sementes recalcitrantes ou intermediárias. As temperaturas são diferenciadas para germoplasma de clima tropical (-20oC) e de clima Subtropcal e temperado (10-15oC). Vantagens: permite coleta em qualquer época do ano; elimina viroses; produz clones; multiplicação rápida; germina sementes imaturas; facilita o intercâmbio e a quarentena. Espécies testadas: mandioca, batata, cana-de-açúcar, banana, baunilha, cacau, fruteiras temperadas, raízes e tubérculos. Desvantagens: alto custo com mão de obra especializada e risco de variação somaclonal.

Na Conservação in vitro são realizadas três atividades básicas:

1. Introdução/estabelecimento do material vegetal;
2. Monitoração/avaliação dos germoplasmas in vitro;
3. Subcultivo/repicagem dos germoplasmas in vitro;

Fluxo das atividades: Os materiais coletados são introduzidos in vitro. Após estabelecimento são mantidos em câmara de conservação (10°C ou 20°C, depende da cultura). São realizadas monitorações periódicas para acompanhamento das condições de sobrevivência dos germoplasmas. Quando a monitoração indica condição de risco de morte das plantas,o material é subcultivado. Após subcultivo (repicagem), os germoplasmas são novamente colocados nas câmaras de conservação e o ciclo reinicia.

Estabelecimento/Introdução de germoplasmas in vitro

Os materiais a serem conservados podem chegar ao laboratório de cinco formas.

1. sementes
2. tubérculos
3. plantas
4. ramas
5. in vitro

Quando chegam em sementes e tubérculos, já são desinfestadas,quando em plantas, são retirados as gemas apicais e laterais(explantes), quando em ramas são plantadas em casa de vegetação, e depois retirados os brotos(explantes) para desinfestar e colocar em meio de cultura,são desinfestadas com álcool 70% mais hipoclorito de sódio a 2,5%, por vinte minutos, e lavadas, dentro da câmara de fluxo laminar, por 03 vezes, em seguida feita a introdução em meio de cultura especifico. quando o material vem já in vitro, apenas são multiplicados e colocados em câmaras de crescimento 25°c. Existe uma planilha para este processo onde temos: Anotação para estabelecimento/introdução in vitro -Nome do técnico: - Data da introdução: -Espécie ou nome comum: -BRA -Tipo de material recebido: qual a forma do material recebido, se foi ramas, tubérculos, plantas,sementes ou in vitro. -Data da introdução no Cenargen: -Método de esterilização dos explantes: -Meio de cultura usado: - números de tubos feitos: -Localidade: câmara - temperatura: 25°c -Luminosidade: -Numero da grade: -Observação:

Monitoração dos acessos das coleção in vitro

A monitoração consiste na avaliação, de diferentes aspectos pré-determinados, realizada em cada acesso da espécie, conforme a lista a seguir

• N° de tubos totais (atualmente estamos padronizando 10 tubos/acesso, mas esse valor ainda não está bem definido);
• N° de tubos contaminados por fungo;
• N° de tubos contaminados por bactérias;
• N° de tubos com planta morta mas crescida;
• N° de tubos com planta morta e não crescida;
• N° de tubos com planta viva mas sem crescimento;
• N° de tubos com planta com tamanho abaixo da metade do tubo;
• N° de tubos com planta com tamanho acima da metade do tubo, mas que ainda não atingiu o topo;
• N° de tubos com planta com tamanho maior que tubo, por já atingir o topo;
• N° de tubos com planta que apresenta brotação;
• N° de tubos com planta que apresenta alguma gema viva, mas todas as folhas estão mortas/amarelas;
• N° de tubos com planta que apresenta gemas laterais vivas, mas ápice morto;
• N° de tubos com raiz ausente;
• N° de tubos viáveis para próxima repicagem (planta apresenta alguma gema viva e nenhuma contaminação);
• N° de tubos contaminados, mas que podem ser viáveis caso necessário;
• N° de tubos descartados;
• N° de tubos com planta que apresenta tubérculo (usado apenas na coleção de batata).

Levando em consideração esses aspectos é definido a última coluna: Acesso necessita de repicagem: sim(1) e não(0). Nesse momento também classifica a urgência em que deve ocorrer essa repicagem. Essa classificação é feita através da localização; os materiais com condição muito crítica são colocados em grades identificadas com legenda URGn° e repicados imediatamente; os materiais que já precisa de repicagem, mas não apresenta condição crítica, são colocados em grades identificadas com legenda Rn° e repicados após os urgentes; caso exista materiais que não serão repicados são colocados em grades identificadas com legenda Nn°. No fim da repicagem renumeramos todas as grades na ordem em que foi repicadas.

Subcultivo ou repicagem de germoplasma in vitro

O subcultivo ou repicagem é a troca de meio da planta.Após a monitoração, se ficou definido que necessita de subcultivo, faz-se o meio daquela cultura e prepara a câmara de fluxo laminar para efetuar a repicagem.Faz-se a anotação de todo o material em ficha adequada. Onde é retirado a gema apical e colocado em um meio novo, fechando-o e identificando-o.Caso a planta não apresente gema apical, faz-se usando gemas laterais e brotações.Normalmente faz-se 10 tubos por acessos, exceto aquele que necessite multiplicação. Depois de todos repicados são levados a câmara de conservação (20°c), ou a câmara de crescimento para que o material cresça mais rápido e mais forte.